探究力学对胚泡植入和胎盘发育影响的研究机制!

探究力学对胚泡植入和胎盘发育影响的研究机制!

近年来我们对在胚胎发育过程中如何引导分子信号通路之机械原理的理解正在不断深入，妊娠早期绒毛膜外滋养层(EVT)对蜕膜的侵袭是胎盘成功的关键。而力学是细胞迁移和干细胞分化的调节因子，明确基质的硬度对于滋养细胞迁移和干细胞研究是否具有生理意义是至关重要的。目前在胚胎植入子宫内膜时，力学所起的作用却鲜为人知。

尽管越来越多的证据表明，机械原理可以诱导细胞分化和迁移，但关注力学在滋养细胞生物学中作用的研究数量有限，机械力对细胞行为有深远的影响，调节细胞分化和迁移。尽管它们很重要，但由于缺乏人类母胎界面力学特性的系统知识，人们对其在胎盘发育过程中对胚泡植入和滋养细胞迁移的影响知之甚少。

来自剑桥大学Y assen Abbas等2019年10月发表在《Human Reproduction》上一篇名为《母胎界面的组织硬度》的研究使用体外原子力显微镜(AFM)进行直接测量，获得了人类非妊娠阶段子宫内膜在月经周期之分泌期、妊娠前三个月蜕膜和胎盘的硬度，并通过对基底膜基质和人体组织使用相同的技术，便于直接比较。另外EVT细胞主要产生有助于基底膜形成的ECM蛋白(图4B)，如胶原蛋白、IV型、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和硫酸肝素，该研究用免疫组化验证了纤维蛋白1定位于细胞角蛋白7+ EVT和一些基质细胞。

1、研究设计、规模：本研究中所测得的刚度称为表观弹性模量，对如下样本的刚度分别进行了测量：人类妊娠期分泌期子宫内膜体外样本(N = 5)和早期妊娠蜕膜(N = 6),壁蜕膜 (N = 5)和胎盘(N = 5)，人工合成的细胞外基质(ECM)和基底膜基质(N = 5),它们常用来研究绒毛膜外滋养层(EVT)在三维空间的迁移和以此进行子宫内膜和类胎盘培养。

2、参与者/材料、设置、方法：使用原子力显微镜进行体外直接测量，以确定新鲜组织样本的硬度。采用免疫组化染色(IHC)， HLA-G+ EVT来鉴定区分基底蜕膜和顶叶蜕膜。子宫内膜用苏木精和伊红染色以确认腔上皮的存在，分析单细胞RNA测序数据，以确定蜕膜细胞和胎盘细胞中细胞外基质(ECM)转录本的表达，利用IHC对基底蜕膜蛋白纤维蛋白1进行染色。

3、主要结果和偶然性的作用：我们观察到基底蜕膜的刚度为1250 Pa，明显硬于壁蜕膜处的171pa(P< 0.05)。壁蜕膜的硬度与未孕子宫内膜和胎盘组织相似(分别为250和232 Pa)。由此推断，正是由于入侵的EVT的存在导致了基底蜕膜硬度的增加，人工基底膜基质的硬度为331 Pa，显著低于基底蜕膜(P< 0.05)。

4、这些发现的更广泛的含义：这些结果提供了对植入窗口期和人类妊娠前三个月组织硬度的直接测量。这为今后探索力学对胚胎植入和胎盘发育的影响奠定了基础。这些发现提供了重要的基线数据，用于在构建滋养细胞干细胞发育和迁移的体外模型时告知基质刚度要求，该模型更类似于在体内的蜕膜。

妊娠前三个月的胎盘和蜕膜组织样本来自常规终止妊娠者(6 ~ 12周妊娠)，子宫内膜样本采集于分泌期，排卵前黄体生成素(LH)激增后7 - 10天。所有受试者在手术前至少3个月均未接受过激素治疗。使用Wallach Endocell取样器(908014A, Wallach Surgical Devices, USA)进行子宫内膜活检，从子宫底部开始，顺势向下至宫颈内口。

图1 妊娠前3个月在母体胎儿界面取样的组织。采用AFM对8 ~ 10周妊娠时获得的基底蜕膜、壁蜕膜和胎盘进行刚度测量。蜕膜采用免疫组化染色，HLA-G+ EVT检查组织是否为基底蜕膜，壁蜕膜为阴性，刻度条为200和100英尺m(插图)。

结果分析：在所有5例匹配样本中，基底蜕膜明显比壁蜕膜坚硬(P <0.05);Mann-Whitney测试(图2B)。所有患者基底蜕膜和壁蜕膜的表观弹性模量分别为1250和171 Pa。基底蜕膜显示的区域硬度增加，导致更宽测量的表观弹性模量的分布。非妊娠子宫内膜月经周期分泌期的表观弹性模量为250 Pa(图2C)，与壁蜕膜无显著差异(P >0.05;Mann-Whitney;N=5)。非妊娠子宫内膜患者的表观弹性模量范围有显著差异。非妊娠子宫内膜患者的表观弹性模量有显著变化，以P7和P9之间的差异最为明显，分别为10.77 - 1328.7 Pa和4.8 - 131.9 Pa(图3)。目前尚不清楚这是由于这些组织的真正机械差异，还是其他因素如子宫内膜活检的位置。考虑到这些患者接受已知的生育问题的调查，可能会有与子宫内膜检查相关的病理。

EVT细胞主要产生有助于基底膜形成的ECM蛋白(图4B)，如胶原蛋白、IV型、纤维连接蛋白、层粘连蛋白和硫酸肝素(Lowe et al.， 2015)。本分析提示蜕膜分离的EVT产生纤维蛋白1。纤维蛋白1是微纤维的主要成分，在大量结缔组织中提供结构支持。通过对基底蜕膜的连续切片进行免疫组化，我们证实了纤维蛋白1定位于细胞角蛋白7+的 EVT上和一些基质细胞中(图4C)。

胎盘是支持胎儿生长发育的胚胎外器官。在妊娠的前三个月，它接触到蜕膜腺的分泌物，然后介导母体血液中的营养物质的输送，这一供应在妊娠期约11周时就建立起来了。8-10周胎盘绒毛标本的表观弹性模量为232pa(图2C)。纤维蛋白1是一种已知的在结缔组织中提供结构支持的糖蛋白，发现在EVT和基质细胞中都有表达。

用免疫组化法在EVT细胞上检测纤维蛋白1的表达，对细胞角蛋白7(存在子宫腺和EVT)和纤维蛋白1 (存在EVT和蜕膜基质细胞)连续切片染色。基底蜕膜硬度的增加可能是由于EVT侵袭引起的改变。EVT细胞以可控和定向的方式侵入蜕膜，重塑螺旋动脉，将其转变为高度扩张的血管，能够为胎儿提供足够的营养和氧气(Jauniaux et al.， 2000)。当EVT入侵时，它们降解基质ECM蛋白，同时产生自己独特的ECM网络(Burrows et al.， 1996;(朱等，2012)。组织的刚度与ECM蛋白的种类和数量相关(Handorf et al.， 2015)。因此，EVT细胞在蜕膜中沉积哪些ECM蛋白是很重要的。纤连蛋白是产生EVT基质的主要成分，但它通常存在于基底膜中，与组织硬化无关。

最近的妊娠早期蜕膜scRNAseq提示EVT合成了包括纤维蛋白1在内的其他ECM蛋白，我们通过免疫染色证实了这一点(图4)。纤维蛋白1是一种糖蛋白，在ECM中聚集形成10-12纳米的微纤维(Handford, 2000)。它的功能是提供两种结构支持以及通过与生长因子的特定相互作用实现内稳态，而且通常在结缔组织中被发现(Zhang et al.， 1995;Handford, 2000)。它作为纤维增强复合材料有助于增加组织刚度，证据主要是存在于富含弹性蛋白的组织内。

局部刚度差异会影响EVT迁移，EVT单元刚度变化最大的是当它们到达肌层，即蜕膜下面的肌层。平滑肌组织的硬度为 5kpa，是基底蜕膜的5倍(Butcher et al.， 2009)。在正常妊娠中，EVT细胞一旦到达子宫肌层的内三分之一就停止迁移，在那里它们最终分化为多核巨细胞。

最后，基质凝胶®是研究体外三维EVT迁移的最常见底物，最近，它被用于建立胎盘和子宫内膜的类器官(Boretto et al.， 2017;Turco等，2017年，2018年;Haider等，2018年)。我们发现Matrigel®比蜕膜基底肌柔软大约一个数量级，对于研究EVT迁移到蜕膜基底肌并不具有生理意义。相比之下，Matrigel®在非妊娠分泌期子宫内膜和胎盘的测量范围内，这使得它适合研究早期囊胚着床，并可能解释其作为基质在这两种组织的器官样培养生长的成功使用。稀释基质凝胶®浓度可用于调整刚度以匹配所需的组织。然而，一个主要的缺点是批次间蛋白质含量的差异。我们发现，在5批中测量的硬度范围从243Pa -512 Pa，这与之前使用AFM对Matrigel®进行的测量结果一致(Soofi et al.， 2009)。从长远来看，需要更多的合成基板，其ECM含量和刚度都是确定的以确保实验之间的一致性。这些基质的组成可以调整，以更紧密地反映蜕膜的刚度。

总结：力学现在被广泛认为是细胞行为的重要调节器。然而，有关其对胚泡植入和胎盘发育影响的研究机制一直缺乏。在这里，Y assen Abbas等发现非妊娠子宫内膜、壁蜕膜和胎盘的硬度为 102Pa，而基底蜕膜为103Pa。这里生成的数据可以作为未来母胎界面力学研究的基础，并优化目前正在开发的以求更接近真实组织环境的3D培养和迁移测定。

编审专家王蔼明：主任医师，教授，博士生导师，解放军总医院第六医学中心、生殖医学中心创始人、中国优生优育协会理事、第四届中华医学会生殖分会委员、中华医促会生殖分会常委、国家生殖医学专家库专家。

王蔼明教授擅长妇科微创、生殖内分泌、生殖相关疾病及妇科肿瘤的诊断与治疗、移植前子宫内膜容受性的调理，对子宫内膜容受性的宫腔镜诊断与治疗有丰富经验和独到见解，国内外发表相关文章20余篇。

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